outline.org

   1 * Introduction
   2   - motivate fluorescence microscopy
   3   - explain its drawbacks (usually only 5s exposure without changing biology)
   4 * Methods and Results
   5 ** The optical system
   6 # /data/floh-junk/0117/final/kielhorn-ssi2011_0120.pdf
   7    - distance between consecutive lenses always sum of both focal lengths
   8    - source is output of integrator rod
   9    - if mirrors are flat, image of source on B1
  10    - if mirrors are tilted, light no longer passes through the aperture
  11    - mma is imaged into bfp, tilted mirrors are dark there
  12    #+CAPTION: Thin lens model of the optical system. L{1..5} lenses, M{1,2,3} mirrors, B1 adjustable aperture, PBS polarizing beam splitter, D1 dichroic beam splitter
  13    [[./img/sketch.jpg]]
  14    #+CAPTION: Photograph and drawing of the system.
  15    [[./img/setup.jpg]]
  16    - give examples how it can be used to improve illumination
  17      for c. elegans samples
  18 ** mma simulation
  19    - first order in b1 is at an angle FIXME
  20    - aperture stop should have FIXME diameter
  21      - ideally half orders should be blocked
  22    - this leads to an image diameter on the lcos, in the sample plane FIXME
  23 ** light homogenization
  24    - fiber illuminated under an angle
  25    - rotating microlenses with 5 degree divergence FIXME
  26    - 250mm light tunnel, needs to be rectangular for mixing effect,
  27      caustics in round tunnels prevent homogenization FIXME paper
  28 ** Other approaches of light control
  29    - other approaches in the literature:
  30      - SPIM
  31      - HiLo
  32      - CLEM, feedback loop paper
  33      - Levoy
  34   - comparison of the different approaches
  35     - SPIM and HiLo only do angular control
  36     - SPIM doesn't seem to have any real disadvantage, its sectioning (1 .. 3 um?)
  37       isn't as good as CLEM but usually sufficient for embryos
  38     - CLEM only works with coherent light and can do good sectioning with a confocal
  39     - Levoy spatial resolution is limited and fixed (depending on what
  40       microlenses he uses), our system has high spatial resolution but
  41       we shouldn't make use of it otherwise the angular control
  42       doesn't work
  43     - Levoy is the only one, that can instantaneously illuminate
  44       different regions of the sample with different angles. We (and
  45       Holo and Kino) could multiplex in time, though.
  46     - Holo is an approach that we tried using a different phase
  47       gratings in the image plane.
  48     - Kino would be an approach where several phase SLM would act as a
  49       Kinoform element and redistribute light from dark areas into the
  50       bright ones (hasn't been tried to my knowledge).
  51
  52
  53 | Approach | Angular | Spatial | Sectioning | Throughput | Incoherent | Advantage        | Disadvantage    |
  54 |----------+---------+---------+------------+------------+------------+------------------+-----------------|
  55 | SPIM     | ++      | -       | +          | ++         | +          | even drosophilia | sample mount    |
  56 | HiLo     | ++      | -       | o          | o ?        | +          |                  | untilt          |
  57 | CLEM     | -       | ++      | ++         | ++         | -          |                  |                 |
  58 | Levoy    | +       | +       | - .. o ?   | o          | ++         |                  | adaptive        |
  59 | Holo     | +       | +       | -          | -          | --         | only one SLM     | discrete angles |
  60 | Kino     | +       | +       | -          | + or ++ ?  | --         |                  |                 |
  61 | Our      | +       | ++      | - .. ++ ?  | -          | -          |                  | adaptive        |
  62
  63 ** The electronic system
  64    - explain how devices are synchronized
  65 *** Liquid crystal on Silicon Display
  66   - maybe describe how it works (but there isn't much information available)
  67 *** Micro mirror array
  68    #+CAPTION: MMA images, left: SEM image, middle: optical reflective , right: exaggerated rendering of how a 8x8 checker pattern would be displayed on the device
  69    [[./img/mma.jpg]]
  70    - 256x256 mirrors with 16 um pitch
  71    - angle continously adjustable from 0 to 2 degree (blazed condition
  72      for full visible range)
  73    - use fourier filter to convert into intensity device
  74    - Fraunhofer contrast measurement
  75      - tilt all mirrors, keep frame flat
  76      - measure intensity at three areas in the filtered image
  77      - plot intensity versus deflection, find minimum
  78 *** Camera
  79 ** The optimization system
  80 *** Illumination optimization via Raytracing
  81 *** Expected improvement with controlled light exposure (lack of Simulation will make that hard to write)
  82 *** Expected improvement with angular illumination
  83 *** Experimental results
  84 * Summary
  85 * Appendix
  86 ** Simulating the microscope
  87 *** Raytracing through immersion objective
  88 *** On locating nuclei
  89 *** On tracking nuclei
  90 *** Angular point spread function
  91 *** Comparison of widefield and spatio-angular illumination
  92
  93 #+BEGIN_VERSE
  94 % memi_inten.m
  95 function inten=memi_inten(px,py,mpx,mpy,mr,lpx,lpy,lr,h_asf,filtersize)
  96 Ex=squeeze(h_asf(:,:,:,0));
  97 Ey=squeeze(h_asf(:,:,:,1));
  98 Ez=squeeze(h_asf(:,:,:,2));
  99
 100 %% Lightsource
 101 sx=size(h_asf,1);sy=size(h_asf,2);sz=size(h_asf,3);
 102 %px=13;py=13;
 103 %mpx=5;mpy=0;
 104 %lpx=7;lpy=5;
 105 tun=newim(sx,sy);
 106 tun(px,py)=1;
 107 ft_tun=ft(tun);
 108 %% MMA
 109 t=sqrt((xx(sx,sy)-mpx).^2+(yy(sx,sy)-mpy).^2)<mr;
 110 if filtersize>0
 111     t=gaussf(t,filtersize);
 112 end
 113 lcos_ill=ift(ft_tun.*t);
 114 %% LCOS
 115 L=sqrt((xx(sx,sy)-lpx).^2+(yy(sx,sy)-lpy).^2)<lr;
 116 lcos_out=lcos_ill.*L;
 117 %% Apply ASF to Amplitude after LCOS
 118 lcos_3D=newim(sx,sy,sz,'complex');
 119 lcos_3D(:,:,floor(sz/2))=lcos_out;
 120 Esx=convolve(lcos_3D,Ex);
 121 Esy=convolve(lcos_3D,Ey);
 122 Esz=convolve(lcos_3D,Ez);
 123 inten=real(Esx*conj(Esx)+Esy*conj(Esy)+Esz*conj(Esz));
 124
 125 % memi.m
 126 %% Lightsource
 127 sx=30;sy=30;sz=30;
 128 px=17;py=17;
 129 mpx=5;mpy=0;
 130 lpx=7;lpy=5;
 131 lr=10;mr=3;
 132 %% ASF
 133 h_asf=kSimPSF( {'na',1.38;'ri',1.52;'sX',sx;'sY',sy;'sZ',sz;'scaleX',80;'scaleY',80;'scaleZ',160;'computeASF',1;'circPol',0;'scalarTheory',0})
 134 h_asf=squeeze(h_asf);
 135
 136 %% incoherent
 137 incor=0;
 138 for px=0:29
 139     for py=0:29
 140         inten=memi_inten(px,py,mpx,mpy,mr,lpx,lpy,lr,h_asf,1);
 141         incor=incor+inten;
 142         fprintf('px: %d, py: %d\n',px,py);
 143     end
 144 end
 145 #+END_VERSE
 146
 147 *** Optimization of illumination
 148 ** Camera calibration
 149    compare performance of different cameras (SNR agains light
 150    intensity), support our choice of camera
 151 ** On measuring light intensity in the focal plane
 152 ** On the choice of the objective
 153    explain our choice of the objective
 154 ** Controlling the micro-mirror array
 155 ** Synchronizing electronics by microcontroller
 156 ** Preparing C. elegans embryos for imaging
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